Jaroslav Pešina se narodil v Praze do rodiny Zdenky Meisnerové a Jana Bedřicha Pešiny, velkoobchodníka s kávou a cukrem, a v Praze působil po celý svůj život. V mládí se zabýval astronomií, nakonec se však po absolvování gymnázia v Křemencové ulici rozhodl pro studium dějin umění. Na FF UK je studoval pod vedením V. Birnbauma, A. Matějčka a J. Cibulky, všeobecné dějiny pak pod vedením J. Šusty. Především díky A. Matějčkovi směřoval Pešina k všestrannému zájmu o české i evropské umění. Roku 1936 úspěšně obhájil svou dizertační práci Pozdně gotické deskové malířství v Čechách do doby kolem r. 1500. Jednalo o do té doby opomíjené téma a J. Pešina představil ve své práci několik nově objevených uměleckých děl.
Roku 1939 obdržel Římské stipendium na pobočce Českého historického ústavu v Římě. V období druhé světové války a prvních let po válce pracoval ve Sbírce starého umění NG v Praze. Společně s J. Cibulkou sváželi na začátku německé okupace movitý majetek, především obrazy, z ohrožených míst a umisťovali jej do Národní galerie. Zachránili tak cenná díla například z Konopiště, ale i ze soukromého majetku, jako v případě sbírky rodiny Bělských. Během svého působení v NG Jaroslav Pešina napsal své stěžejní syntézy i řadu studií a článků týkajících se převážně české deskové malby. Patří mezi ně především Pozdně gotické deskové malířství v Čechách, Česká malba pozdní gotiky a renesance. v nich položil základy bádání v oblasti malby pozdní gotiky a renesance, v němž následně pokračovala generace jeho žáků.…
…byl představitelem klasického formálně-stylového pojetí, založeného na důkladné tvarové a stylové analýze a hledání paralel mezi domácím a zahraničním uměním
Z výše uvedených titulů z pera Jaroslava Pešiny je zřejmé, že hlavním zájmem jeho bádání byla středověká malba, především česká desková. K tomuto tématu publikoval jak větší syntézy, tak studie konkrétních umělců a děl. Nejvíce pozornosti věnoval tvorbě Mistra litoměřického oltáře, dále lze zmínit studie o Mistru vyšebrodského cyklu či o Mistru svatojiřského oltáře. Zásadním způsobem tak přispěl k poznání kapitoly českých dějin umění do té doby spíše opomíjené, tedy období mezi husitskými válkami a nástupem Habsburků na český trůn. Svým badatelským přístupem byl Pešina představitelem klasického formálně-stylového pojetí, založeného na důkladné tvarové a stylové analýze a hledání paralel mezi domácím a zahraničním uměním. V pozdějších letech (především v monografii o Mistru Vyšebrodského cyklu) doplnil svůj přístup o poznatky z ikonografie. Při analýze jednotlivých děl úzce spolupracoval také s věhlasným českým restaurátorem Bohuslavem Slánským.
Na profesi historika umění kladl Pešina velké nároky, které zformuloval ve své přednášce Metoda a technika vědecké práce. Podle něj by měl historik umění znát nejen samotné umění, ale také druhy květin, psů atd., aby byl schopen přesně určit sledované dílo. Svým studentům radil, aby se kromě architektury, sochařství a malby zajímali také o hudbu, protože si byl vědom toho, jak důležitý je pro historika umění všeobecný kulturní rozhled. Zároveň by měl být uměleckohistorický text napsán nejen exaktně, ale také krásným jazykem — neboť o „krásných věcech se má krásně psát“ — a srozumitelně, aby mu porozuměla širší veřejnost. Podle Jaroslava Pešiny „psaní je jako cvičení na hudebním nástroji“, je třeba svůj slovesný projev kultivovat. Zároveň vedl své studenty heslem „Nula dies sine litera“, kterým nabádal k neúnavné každodenní vědecké činnosti a kterým se ostatně sám řídil.
Roku 1950 se stal Pešina řádným docentem dějin umění na Ústavu pro dějiny umění FF UK, o čtyři roky později byl jmenován řádným profesorem. V čele ústavu stál v letech 1963–1970, mezi lety 1954–1956 zastával funkci proděkana filozofické fakulty. Ve svých přednáškách se věnoval středověké a renesanční tématice (přednášky České umění gotické I a II, seminář Středověká nástěnná malba, České a slovenské umění renesance), zároveň převzal po smrti N. L. Okuněva kurz umění východních Slovanů. Mezi žáky, ale i mladšími kolegy měl Jaroslav Pešina velkou autoritu. Své pozitivisticky laděné přednášky zaměřoval na architekturu, sochařství, malířství i užité řemeslo doby středověku. Zásadními pro formování budoucích historiků umění byly jeho semináře a prosemináře. V nich seznamoval studenty s pojmoslovím v architektuře, výtvarnými technikami, liturgickými předměty či s ikonografií. Jejich součástí byla i analýza a interpretace obrazů. Při promítání diapozitivů profesor kladl studentům dotazy na námět, kompozici, formální znaky, pojetí figury, prostoru, krajiny atd. a nenápadně je tak vedl k určení doby vzniku a přesnějšímu zařazení včetně autorství.
…pravidelně se účastnil exkurzí katedry, při nichž se plně ukázal jeho živý zájem o věc, a tak se program exkurze leckdy protáhl až do půlnoci.
Prosemináře byly založeny z velké části na studentských referátech, které musely být precizně zpracované. Mezi Pešinovy nejvýraznější žáky patří J. Krása, J. Kropáček, P. Wittlich, H. Soukupová, Z. Všetečková či F. Šmejkal. Jako jeho asistent působil na ústavu P. Kropáček. Ve vzpomínkách na J. Pešinu se jeho bývalí žáci zmiňují o jeho noblesnosti, distingovanosti, serioznosti, taktnosti a o jeho velké pečlivosti, s níž připravoval svoje přednášky. Výrazným rysem Pešinovy povahy byla prý jistá odtažitost, která však obzvláště během jeho seminářů polevila a projevil se i Pešinův smysl pro humor. Žáci, kteří mu byli obzvláště blízcí (například jim vedl závěrečnou práci), za ním dokonce jezdili do Senohrab. Pešina se spolu s J. Homolkou, V. Menclem a J. Neumannem pravidelně účastnil exkurzí katedry, při nichž se plně ukázal jeho živý zájem o věc, a tak se program exkurze leckdy protáhl až do půlnoci. Nejen studenti ale i jeho kolegové si ho velmi vážili. Vřelé přátelství pojilo J. Pešinu především s jeho kolegou medievalistou J. Homolkou.
Roku 1970 vystřídal Pešinu v čele Ústavu pro dějiny umění V. Fiala. Stalo se tak z politických důvodů. Jaroslav Pešina vstoupil do komunistické strany již roku 1945, nepatřil však k aktivním členům a v roce 1970, v rámci stranických prověrek na začátku tzv. normalizace, byl z KSČ vyškrtnut. Na fakultě ale mohl působit dál — až do roku 1980 na katedře přednášel dějiny gotického malířství, vedl proseminář a podnikal řadu exkurzí po republice. Strávil zde tedy celé čtvrt století.
Ukončení pedagogické činnosti pro Jaroslava Pešinu neznamenalo útlum v publikační činnosti, právě naopak. V sedmdesátých a osmdesátých letech 20. století se podílel na stěžejních syntetických pracích o českém gotickém umění. Vedle studie o deskové malbě v Českém umění gotickém 1350–1420 je třeba zmínit Pešinův podíl na knize Pozdně gotické umění v Čechách 1471–1526, na níž spolupracoval s J. Petráněm, V. Menclem, J. Homolkou a J. Krásou, nepřehlédnutelné jsou rovněž jeho kapitoly v prvních dvou dílech Dějin českého výtvarného umění. Pešina zároveň výrazně přispěl k uznání české medievistiky v zahraničí. S tím souviselo také jeho působení v Mezinárodním komitétu dějin umění. V roce 1972 byl u příležitosti svých šedesátých narozenin oceněn prestižní Johann-Gottfried-von-Herder-Preis, udělovanou na popud podnikatele a filantropa Alfreda Toepfera (1894–1933) v oblasti kultury od roku 1935 nejčastěji osobnostem z řad spisovatelů, historiků, etnografů či památkářů. Po jistých peripetiích nakonec mohl převzít ocenění ve Vídni osobně.
Svým zájmem o německé a rakouské středověké malířství dal podnět ke zhodnocení fondů zahraničního umění v českých sbírkách.
Vedle deskové malby se J. Pešina zabýval také nástěnnou malbou středověkou a renesanční a renesančním portrétem. V souvislosti s nástěnnou malbou je třeba zmínit alespoň kompendium Gotická nástěnná malba v zemích českých I vydané Československou akademií věd. Pod Pešinovou záštitou se na knize podíleli mj. Karel Stejskal, Anežka Merhautová a Jarmila Krčálová. Detailně se věnoval problematice prostoru ve středověké malbě a architektuře na Giottových obrazech. Svým zájmem o německé a rakouské středověké malířství dal podnět ke zhodnocení fondů zahraničního umění v českých sbírkách. Jeho plodné badatelské aktivity ilustruje množství korespondence uložené v archivu NG. Z řad českých historiků umění mu byl v tomto směru nejblíže J. Cibulka, Z. Wirth, F. Kovárna a P. Kropáček. Osobnějšího charakteru jsou dochované listy od A. Masarykové a pochopitelně A. Matějčka. Z řad zahraničních badatelů, kterým Jaroslav Pešina adresoval své dopisy, je třeba zmínit alespoň Theodora Müllera, ředitele Bavorského národního muzea v Mnichově, Otto Bensche, ředitele vídeňské Albertiny, Gerharda Schmidta, profesora vídeňské univerzity, Otto Pächta působícího po druhé světové válce v Oxfordu, Dagoberta Freye, Jana Białostockého z Varšavy či italského historika umění Nicola Rasma. Korespondence se zahraničními kolegy se týkala především odborné literatury — Pešina byl jazykově velmi dobře vybaven, vedle němčiny, francouzštiny a ruštiny ovládal také italštinu.
Jeho badatelskou činností však prostupují také témata zcela odlišná od jeho medievistického zaměření, intenzivněji se jim věnoval ve čtyřicátých a padesátých letech 20. století. Patří mezi ně kniha o malířské tvorbě Mikoláše Alše, studie zaměřené na českou vedutu 19. století či na portrétní tvorbu A. Machka. Během přípravy knihy Česká moderní grafika pro grafické sdružení Hollar se dostal do kontaktu, jak dokládá dochovaná korespondence, např. s F. Bílkem, F. Dušou a Q. Kocianem. Jiní významní umělci té doby jako K. Lidický a F. Emler jej portrétovali.
Většinu svých prací napsal J. Pešina ve svém smíchovském bytě, svůj volný čas trávil v nedalekých Senohrabech. Tamní vilu zakoupil kdysi tchán A. Matějčka a časem se stala výrazným společenským a kulturním centrem. Postačí zmínit některé z hostů, kteří do Senohrab za A. Matějčkem a J. Pešinou jezdili: V. Denkstein, V. V. Štech, J. Šusta, J. Kotalík, sestry Masarykovy, F. Dvořák, P. Preiss, P. Witlich, J. Pečírka, J. Neumann z řad historiků umění, dále sochař B. Kafka, ilustrátor O. Sekora, malíř F. Muzika, ale také řada herců či lékařů.